ПРИЛОЖЕНИЕ 4
Обязательное
1. Получение чистых культур плесневых грибов
Чистые культуры плесневых грибов получают один раз в 3 года в институте биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР. При выборе штаммов руководствуются "Каталогом культур микроорганизмов, поддерживаемых в учреждениях СССР".
2. Выращивание и пересев культур грибов
2.1. Культуры грибов, полученные в запаянных ампулах, восстанавливают согласно прилагаемой инструкции и определяют сохранение их морфолого-культуральные признаки.
2.2. Восстановленные культуры грибов пересевают в пробирки со скошенной питательной средой с агаром. Количество партий должно быть не менее двух. Одна партия является музейной и используется для длительного хранения чистых культур грибов (далее - музейная). Другая партия является исходной для получения рабочих партий культур грибов (далее - исходная).
2.3. Количество исходных и рабочих партий зависит от объема испытаний.
2.4. Исходная партия культур грибов обновляется один раз в 3 меc.
2.5. Рабочие партии культур грибов выращивают за 14 сут до начала испытаний и используют для получения споровой суспензии грибов.
2.6. Культуры грибов пересевают в пробирки на скошенную твердую питательную среду в пылезащитном боксе, предварительно продезинфицированном (п.5.3.5).
2.7. На пробирках обозначают виды грибов и дату пересева, которую заносят в журнал регистрации пересева культур грибов.
2.8. Культуры грибов пересевают в пробирки при помощи бактериологической петли, прокаленной над пламенем спиртовой горелки. Петлю изготовляют из проволоки (платиновой, хромовой, никелевой, молибденовой) диаметром (0,6
) мм, длиной (120
) мм. Проволоку укрепляют в стеклянном или металлическом держателе.
2.9. Пробирки, засеянные спорами грибов, помещают в термостат при температуре (29±2) °С на 10-14 сут до появления зрелого спороношения.
2.10. Культуры грибов проверяют на соответствие пересеянному виду и чистоту.
3. Хранение культур грибов методом периодических пересевов
3.1. Музейную партию культур грибов хранят в пробирках на скошенной питательной среде с агаром и пересевают один раз в 6 мес.
Не допускается более семи последовательных пересевов этой партии в течение 3 лет.
3.2. Пробирки с чистыми культурами грибов хранят в холодильнике при температуре (7±3) °С.
4. Хранение культур грибов в стерильной почве
4.1. Для хранения музейной партии грибов используют стерильную садовую плодородную почву.
4.2. Почву просеивают через сито, рассыпают по пробиркам по 5 г и стерилизуют в автоклаве при давлении 100 кПа по 30 мин в течение 3 сут. После автоклавирования пробирки с почвой подсушивают при комнатной температуре в течение 2-3 сут.
4.3. Культуры грибов выращивают на скошенной поверхности среды Чапека-Докса с агаром и с помощью бактериологической петли переносят в пробирки со стерильной почвой.
4.4. Ватные пробки обрезают вровень с краями пробирки и заливают парафином.
4.5. Культуры грибов в стерильной почве хранят в холодильнике при температуре (7±3) °С или при комнатной температуре в течение 3 лет без пересева.
4.6. Для восстановления культур грибов комочки почвы стерильно переносят в пробирки со средой Чапека-Докса с агаром и выращивают по п.2.10.
4.7. Рекомендуется иметь несколько музейных партий культур грибов в стерильной почве и использовать их для получения исходных партий.
5. Питательные среды для выращивания и хранения культур грибов
5.1. Для выращивания всех культур грибов используют среду Чапека-Докса с агаром или сусло-агар с содержанием сахара 6 °Б.
5.2. Для выращивания и хранения Aureobasidium pullulans используют среду Сабуро с агаром.
5.3. Для выращивания и хранения Aspergillus penicilloides используют сусло-агар с 60% сахарозы.
5.4. Для длительного хранения остальных культур грибов используют обедненные среды: картофельно-морковную, картофельно-глюкозную и сусло-агар с содержанием сахара 3,5 °Б.